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          7種細胞凋亡有效的檢測方法

          日期: 2019-06-14
          瀏覽次數: 567
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          一、細胞凋亡的形態學檢測?

          根據凋亡細胞固有的形態特征,人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。

          1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡

          2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

          3 透射電子顯微鏡觀察

          7種細胞凋亡有效的檢測方法

          二、磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)

          磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

          碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。


          注意事項

          1、整個操作動作要盡量輕柔,勿用力吹打細胞。

          2、 操作時注意避光,反應完畢后盡快在一小時內檢測。

          Abbkine的Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒含有Abbkine專有的AbFluor?染料標記的Annexin V,可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡對凋亡細胞進行鑒定和定量。同時使用AbFluorTM染料和碘化丙啶(PI)對細胞進行染色可以區分完整細胞,早期凋亡和晚期凋亡或壞死細胞。


          三、線粒體膜勢能的檢測?

          線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用,多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡,而線粒體跨膜電位的下降,被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件,它發生在細胞核凋亡特征(染色質濃縮、DNA斷裂)出現之前,一旦線粒體DYmt崩潰,則細胞凋亡不可逆轉。

          線粒體跨膜電位的存在,使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質,其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。


          注意事項

          1、保持平衡染液中pH值的一致性,因為pH值的變化將影響膜電位。

          2、與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白,他們將與部分染料結合,降低染料的濃度,引起假去極化。


          四、DNA片斷化檢測?

          細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理后,采用常規方法分離提純DNA,進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色,在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少,還可在分離提純DNA后,用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)使DNA標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。


          1.大分子染色體DNA片段的測定

          2.DNA Ladder 測定

          3.凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析


          五、TUNEL法?

          細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定,并可檢測出極少量的凋亡細胞,因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。


          六、Caspase-3活性的檢測?

          Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著重要的作用,其中caspase-3為關鍵的執行分子,它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中,在凋亡的早期階段,它被激活,活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成,裂解相應的胞漿胞核底物,導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞,caspase-3的活性明顯下降。


          七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析?


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